Mikroskopie je souhrn optických metod používaných k zobrazení struktur, které nedokážeme vidět prostým okem. Lidské oko dokáže rozlišit detaily o velikosti přibližně 0,2 mm. Pokud potřebujeme vidět větší detaily, je nutné použít optickou mikroskopii, která využívá viditelné světlo a dokáže zobrazit detaily o velikosti pouhých 200 nm (0,000 2 mm). Pokud potřebujeme ještě větší rozlišení (zobrazit menší detaily), musíme místo světla použít proud elektronů, čímž se dostáváme do oblasti elektronové mikroskopie.
Optická mikroskopie
Optická mikroskopie využívá pro pozorování objektů viditelné světlo. Maximální rozlišení je dáno vlnovou délkou použitého záření, u viditelného světla jde o rozpětí vlnových délek 380–740 nm. Můžeme tedy pozorovat detaily až o velikosti 200 nm.
Světelný mikroskop se skládá ze tří hlavních součástí:
- Stativ – drží tělo mikroskopu a stolek s preparátem.
- Osvětlovací soustava – poskytuje světlo procházející vzorkem, vzorek musí být alespoň částečně průhledný. U nejjednodušších mikroskopů se využívá světlo stolní lampy odražené zrcátkem, kvalitnější mikroskopy mají zdroj světla vestavěný do spodní části optické soustavy.
- Optická soustava – některé mikroskopy mají mezi zdrojem světla a preparátem optickou soustavu, která zlepšuje vlastnosti mikroskopu. Skládá se z clon, kondenzoru a různých filtrů, např. polarizačního.
- Objektiv – soustava čoček, která zobrazuje pozorovaný předmět zvětšený, ale převrácený. Kvalitnější mikroskopy mají více objektivů umístěných na otočném revolverovém držáku.
- Okulár – soustava čoček, zobrazuje pozorovaný předmět zvětšený a správně orientovaný (primární obraz).
Vznik zvětšeného obrazu
Objektiv i okulár se skládají ze spojných čoček,[2] které jsou uloženy ve společné ose. Objektiv má malou ohniskovou vzdálenost a je umístěn velmi blízko pozorovaného preparátu. Preparát musí být umístěn v ohnisku objektivu, vzniká nám zvětšený, převrácený obraz. Ten pak putuje do okuláru, který jej dále zvětšuje a znovu převrací, tím získáme primární obraz.
Pozorování v procházejícím světle
Asi nejběžnější metoda, světlo ze zdroje prochází přes vzorek a je zachycováno objektivem. Pozorovaný objekt je tmavý a jeho okolí je světlé.
Metoda tmavého pole
Tato metoda je vhodná pro pozorování malých objektů, např. pylových zrn. Pomocí kondenzory je preparát osvětlen tak, aby na něj dopadaly pouze paprsky pod velkým úhlem. Přímé paprsky jsou absorbovány. Na preparátu pak dochází k rozptylu záření a toto je pak pozorováno. Pozorovaný objekt se pak jeví jako světlý na tmavém poli.
Elektronová mikroskopie
Jak název metody napovídá, využívá elektronová mikroskopie proud elektronů (místo fotonů), tím získáme výrazně vyšší rozlišení i zvětšení. Zatímco u světelného mikroskopu se pohybujeme v oblasti vlnových délek ve stovkách nanometrů, u elektronového mikroskopu se dostáváme až na zlomky nanometrů. Vlnovou délku můžeme snadno vypočítat z hodnoty urychlovacího napětí:
$$\lambda = \frac{h}{p} = \frac{h}{\sqrt{2meU}} = \frac{6,626 070 . 10^{-34}}{\sqrt{2 . 9,109.10^{-31} . 1,602 . 10^{-19} . 100 000}} = 3,878 . 10^{-12}\ m$$
Z výpočtu je vidět, že při urychlovacím napětím 100 kV je vlnová délka elektronů 3,878 pm, čili 0,000 3878 nm. Elektronové mikroskopy dosahují rozlišení až 50 pm a zvětšení až 10 000 000×.
Jako čočky se v elektronových mikroskopech využívají cívky, které fokusují proud elektronů pomocí magnetického pole.
Na obrázku nahoře jsou zobrazeny schémata vybraných typů mikroskopů. Prvním je světelný mikroskop.
Na druhém místě je TEM (Transmission Electron Microscope), který zobrazuje preparát na základě procházejícího proudu elektronů. Vzorek musí být velmi tenký, aby jím elektrony prošly. Vlastní obrázek vzniká velmi podobně jako u světelného mikroskopu.
Třetím mikroskopem je SEM (Scanning Electron Microscope), ten využívá pohyblivý zdroj elektronů. Vzorek je skenován paprskem, v tomto případě se používá několik typů detektorů:
- SE – detektor sekundárních elektronů. Detekujeme elektrony vyražené z elektronového obalu atomů vzorku.
- BSE – detektor zpětně odražených elektronů. Zpětně odražené elektrony pocházejí z elektronového paprsku, jsou rozptýleny interakcí s atomy vzorku. Protože těžší atomy rozptylují lépe než lehčí, jeví se na snímcích jako jasnější. Proto lze tuto metodu využít i k chemické analýze vzorku.
- EDS – energiově disperzní spektrometrie. Využívá se rentgenové záření emitované vzorkem k prvkové analýze. RTG záření vzniká při přeskoku elektronu z vyšší slupky na místo vyraženého elektronu (SE), díky tomu je energie emitovaného záření charakteristická pro daný přechod a tím i pro daný prvek.
Poslední trojice mikroskopů na obrázku patří do skupiny SPM (Scanning Probe Microscope), z nich je v současnosti asi nejzajímavější AFM (Atomic Force Microscope). Princip funkce je podobný gramofonu (starší čtenáři snad ještě znají), pro zkoumání povrchu se používá velmi tenký hrot, špička je tvořena jediným atomem. Na rozdíl od gramofonu se hrot nesmí dotknout povrchu vzorku, zkoumáme silovou interakci mezi atomem na špici hrotu a povrchem vzorku. Na plošku, z které vyčnívá hrot, je namířen paprsek LASERu, který umožňuje sledování změny polohy hrotu.
Odkazy
- Mikroskopické metody
- Čočky
- Supermikroskopy – Aldebaran Bulletin